OpenEye案例 | 和記黃埔與強生發現、優化強效、高選擇性PI3Kgamma/delta雙重抑制劑

原文:Jia, H.; Dai, G.; Su, W.; Xiao, K.; Weng, J.; Zhang, Z.; Wang, Q.; Yuan, T.; Shi, F.; Zhang, Z.; et al. Discovery, Optimization, and Evaluation of Potent and Highly Selective PI3Kγ–PI3Kδ Dual Inhibitors. J. Med. Chem. 2019, 62 (10), 4936–4948. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.8b02014.

PI3K與類風濕性關節炎


PI3K激酶(PI3-Kinase或PI3K)是一類酶家族,它們與多種細胞功能相關,比如細胞生長、增殖、分化、運動性、存活和細胞內運輸等等。根據序列同源性與脂底物的專一性,PI3K激酶家族分為I,II,III類。其中第I類家族受到廣泛的藥物開發研究。PI3K I類成員都是雜二聚體,包含一個小的調節結構域與一個大的110kDa催化結構域。催化結構域有4種不同的亞型:p110α,p110β, p110γ與p110δ。

其中PI3Kα與PI3Kβ廣泛表達,在細胞的生長、存活與增值中起重要作用,抑制PI3Kα與PI3Kβ主要靶向癌癥治療。PI3Kγ主要表達于粒細胞、單核細胞和巨噬細胞,而PI3Kδ還見于B細胞和T細胞。PI3Kγ或PI3Kδ基因敲除的小鼠存活、可生育,但表現出先天免疫以及適應性應答的顯著缺陷。因此,PI3Kγ或PI3Kδ專一的抑制劑是潛在自身免疫疾病的治療靶標,并且對總的PI3K信號通路不產生干擾、不影響其它細胞的正常功能。

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種引起自身免疫疾病,引發關節炎癥與組織損傷。T細胞、B細胞、肥大細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的活性可以影響疾病的一個或幾個方面。考慮到PI3Kδ與PI3Kγ在這些細胞中的功能,以及它們在RA滑膜和成纖維細胞樣滑膜細胞(FLSs)中的大量表達,PI3Kδ與PI3Kγ是潛在的類風濕性關節炎治療靶標。

目前已有PI3Kδ抑制劑進入臨床開發階段。Idelalisib也稱為GS-1101、CAL-101或Zydelig(見Figure 1的化合物1),是首個被FDA批準的PI3Kδ抑制劑,用于治療濾泡性淋巴瘤(FL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL);與抗CD20利妥昔單抗聯合治療復發性慢性淋巴細胞白血病(CLL)。Umbralisib(見Figure 1的化合物2)是一個小分子PI3Kδ抑制劑,由TG Therapeutics開發,目前處于PIII階段與抗CD20抗體ublituximab聯合治療血液系統惡性腫瘤。 近年來,越來越多的選擇性更好的PI3Kδ抑制劑進入臨床試驗階段。

PI3Kγ與PI3K&deltaa;抑制劑

Figure 1. PI3Kγ與PI3Kδ抑制劑

盡管單獨抑制PI3Kγ或PI3Kδ在自身免疫和腫瘤疾病中提供了獨特的治療機會,但同時抑制這兩種亞型可以在治療多種復雜的免疫介導的炎性疾病中產生優異的臨床功效。 已知這兩種酶都有助于支持惡性B細胞和T細胞的生長和存活,在支持性腫瘤微環境的形成和維持中起到關鍵作用。靶向PI3Kγ和PI3Kδ都可以用于腫瘤治療,如慢性淋巴細胞白血病,急性髓性白血病,非霍奇金淋巴瘤和多發性骨髓瘤。

Infinity制藥公司開發的Duvelisib(見Figure 1化合物4)是首個報道的PI3Kγ/PI3Kδ雙重抑制劑,證明通過雙重阻斷可以實現適應性和先天免疫功能的聯合抑制,從而在動物模型中的多種炎癥和自身免疫疾病中產生顯著的治療優勢。然而,在使用甲氨蝶呤背景的雙盲,安慰劑對照2期研究中,Duvelisib未能在RA患者中顯示出積極的臨床反應。基于作者自己的PKPD模型,他們推測臨床劑量(1 mg和5 mg,每天兩次)都不能提供足夠的藥物暴露來抑制這兩個靶標(特別是PI3Kγ)以產生臨床反應。在2018年,Duvelisib被批準用于治療患有復發或難治性慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤的患者。 Rhizen Pharmaceuticals S.A.也完成了PI3Kγ/PI3Kδ雙重抑制劑Tenalisib(Figure 1化合物5)的I期臨床研究,以治療復發或難治性血液系統惡性腫瘤患者,包括T細胞淋巴瘤。

在本研究中,作者描述了發現新型強效、高選擇性PI3Kγ/PI3Kδ雙重抑制劑的過程,最后發現了口服有效的、用于治療RA和其他自身免疫疾病的候選藥物26。

骨架躍遷:改善DMPK


Duvelisib與PI3Kγ的相互作用

Figure 2. Duvelisib(化合物1)與PI3Kγ的結合模式(PDB 2CHW):鉸鏈區與V882和E880的骨架形成氫鍵相互作用;特異性片段與M804發生疏水相互作用,并且與W812有邊緣-π相互作用,W812是兩種相互作用中較強的一種。

如前面提到,模擬顯示Duvelisib(化合物1)在臨床上沒有對RA顯效可能是因為臨床劑量(1 mg和5 mg,每天兩次)都不能提供足夠的藥物暴露來抑制這兩個靶標(特別是PI3Kγ)以產生臨床反應。因此,本項目的首要目標替換化合物1喹唑啉酮片段(Figure 2化合物1陰影區)以發現DMPK性質更理想的化合物。理想的替換片段不僅與化合物1具有相似的匹配,而且具有相似的相互作用模式,尤其是與P-Loop區W812的相互作用。

第一步是使用生物電子等排物替換工具BROOD對分子的喹唑啉酮片段進行虛擬篩選以發現可行的特異性替換片段。BROOD提供了先導物躍遷和頭腦風暴式的可選方法,給出許多的潛在片段替代方案。為了對BROOD給出的結果進行合成優先性排序,又用靜電相似性工具EON對BROOD結果進行打分,發現了多種潛在的片段。用裸眼比較替代片段與參比片段的靜電勢,進行可視化分析后,認為吡咯并三嗪酮與化合物1的喹唑啉酮具有最相似的靜電特征(見Figure 3),因此選擇這個片段進行后續的化學研究。在該研究中作者詳細描述了吡咯并三嗪酮PI3Kγ/δ雙重抑制劑先導化合物優化的詳細過程。

喹唑啉酮與吡咯并三嗪酮的靜電表面比較

Figure 3. 喹唑啉酮與吡咯并三嗪酮的靜電表面比較

開鏈氨基連接臂的關環:鎖定構象


Rational design of PI3Kγ and PI3Kδ inhibitors

Figure 4. PI3Kγ與PI3Kδ抑制劑的理性設計:開鏈氨基連接臂環合為五元吡咯烷

化合物1的結合模式(Figure 2)表明開鏈氨基連接臂將特異性片段與鉸鏈彼此垂直放置,產生螺旋槳狀形狀。鑒于分子的整體取向及其在結合口袋內的相互作用,作者意識到將開鏈氨基連接臂環化成五元吡咯烷將是結構修飾的可行方法,通過鎖定構象來增強參數(Figure 4)。初始化合物6(以及隨后的7)與PI3Kγ對接計算進一步證實了該想法,對接計算結果顯示:在鉸鏈和特異性片段區域中的關鍵相互作用和化合物整體在結合口袋中的匹配性(Figure 5)與化合物1相當,對接的結合模式還顯示:新的環胺連接臂比開鏈的氨基連接臂更加更充分地占據由M804,I963和M953組成的疏水袋。

化合物6、7與PI3K-Gamma的結合模式

Figure 5. 化合物6、7與PI3Kγ的結合結合模式。疏水相互作用發生于M804、I963與M953形成一個小的疏水口袋(PDB code:2CHW)。

生物活性測試結果表明上述的假設是對的:化合物6對PI3Kγ與PI3Kδ都表現出良好的抑制活性,IC50分別為0.012μM與0.002μM。與原型的化合物1相比,化合物6保留了對PI3Kδ的活性水平,而提高了對PI3Kγ的抑制活性。化合物7對PI3Kγ與PI3Kδ的IC50分別為0.004μM與0.001μM,提高了對PI3Kγ的抑制活性與化合物4相當。這些數據進一步證實了分子對接的結合模式是對的,并且證實將喹唑啉酮替換為吡咯并三嗪酮、以及將開鏈氨基連接臂替換為五元吡咯烷環連接臂是正確的。

五元吡咯環的修飾:代謝穩定性的改進


不幸的是,化合物6、7在大鼠的肝微粒體實驗中顯示出代謝穩定性不好,同時也有必要進一步該進其對PI3Kβ的選擇性。在隨后SAR研究中,主要以提高選擇性,并監控在大鼠與人肝微粒體的代謝穩定性。其中化合物12的對PI3Kβ的選擇性提高了50倍,但在大鼠與人的肝微粒體測試實驗中還是表現出代謝穩定很差,并且預測被嚙齒類動物快速清除。

化合物12的體外代謝產物

Figure 6. 化合物12在人與小鼠肝微粒體中的體外代謝物產物

進一步對化合物12的PK與體外代謝產物研究發現:吡咯烷連接臂被氧化是這些化合物的主要代謝途徑,見Figure 6。為了減少疏水性吡咯烷的氧化來增加代謝穩定性,引入了4元環氮雜環丁烷作為連接臂,其減少了clogP并保留了活性和選擇性所必需的螺旋槳構象。正如所料,與相應的吡咯烷化合物相比,氮雜環丁烷化合物的代謝穩定性得到改善。例如,大鼠肝微粒體實現中氮雜環丁烷20,21和22的剩余百分比分別為63.9%,77.2%和77.5%,并且與相應的吡咯烷類似物7,14和18相比得到很大改善。這種代謝穩定性增加的趨勢在人肝微粒體穩定性測試中也很明顯(見原文表2,博文未給出)。

化合物19

Figure 7. 化合物19的結構以及大鼠與人的肝微粒體代謝穩定性測試RLM與HLM(%)分別為:78.5%與95.4%。

候選化合物26


進一步對4元環類化合物的SAR研究與優化,最終發現了化合物26。體外ADME篩選表明,化合物26更加穩定,RLM與HLM分別63.5%與81.5%。化合物26顯示出體外強效的活性與選擇性,對PI3Kγ、PI3Kδ與PI3Kβ的IC50分別為0.004,0.005,0.590μM。在對458個激酶(395個為野生型激酶,63個為突變型激酶)的激酶譜篩選中,在10μM濃度下對PI3K家族具有顯著的專一性。此外,對50個GPCR蛋白、離子通道與轉運體蛋白均沒有活性。

候選化合物26

Figure 8. 化合物26的結構

進一步對化合物26進行的體外細胞試驗,以了解其對PI3Kδ和PI3K功能活性的影響。PI3Kδ功能的測定包括在人全血中B細胞上的IgM抗體刺激的CD69表達; 大鼠全血B細胞上IgD抗體刺激的CD86表達; 和人全血中fMLP誘導的嗜堿性粒細胞的CD63表達。用于評估PI3Kγ活性的功能測試包括IgE抗體誘導的人全血中嗜堿性粒細胞上的CD63表達。如表4所示,26對嗜堿性粒細胞和B細胞活化表現出有效的抑制作用。 例如,對人全血中嗜堿性粒細胞活化的抑制,IC50為0.042μM和0.337μM,對大鼠全血中B細胞活化的IC50為0.044μM。

用雌性Wistar大鼠進一步評估了化合物26對離體抗IgD誘導的B細胞活化的抑制作用。 26的口服給藥在2h有效抑制抗IgD誘導的B細胞活化,在1mg / kg的劑量下抑制88.3%。 將KC / GRO(也稱為CXCL1,CXC趨化因子)滴注到大鼠皮下空氣囊中誘導了強烈的中性粒細胞趨化性,并且已知該反應涉及PI3K信號傳導。 在大鼠的空氣袋研究中,26小時阻斷KC / GRO誘導的中性粒細胞遷移,在10mg / kg的劑量下抑制87.9%,證實了26對體內PI3Kγ的有效抑制活性。

Table 1. 化合物26的在SD大鼠與Beagle犬上的PK特性

化合物26的PK特性

體內給藥的藥代動力學分析表明,化合物26在大鼠中表現出中度清除率和在狗中表現出低清除率,中等程度的分布容積和高的口服生物利用度(Tabel 1)。當GSH作為輔因子共培養時,在人肝微粒體中未鑒定出谷胱甘肽(GSH)加合物。

我們在已建立的大鼠膠原誘導的關節炎模型中以0.1,1和10mg/kg每天兩次給藥26天,從第10-16天起持續7天。它以劑量依賴的方式顯著降低平均爪子體積,表明顯著的抗炎作用; 估計ED50為0.25mg/kg,BID。1.0mg/kg BID給藥,爪體積減少與第11天至第16天的陽性對照YiSaiPu相當; 從第11天起,10mg/kg BID給藥表現出強效,并且在第16天疾病進展逆轉,幾乎使動物恢復至正常狀態。

總結


Infinity制藥公司開發的Duvelisib是首個報道的PI3Kγ/PI3Kδ雙重抑制劑,在使用甲氨蝶呤為背景的雙盲、安慰劑對照2期研究中,Duvelisib未能在RA患者中顯示出積極的臨床反應。作者基于自己的PKPD模擬,他們推測臨床劑量(1 mg和5 mg,每天兩次)都不能提供足夠的藥物暴露來抑制這兩個靶標(特別是PI3Kγ)以產生臨床反應。以此假設為基礎,作者首先用BROOD對Duvelisib的喹唑啉酮片段進行躍遷,并用EON進行靜電相似性篩選,經過裸眼觀察,最后選擇了吡咯并三嗪酮做為新的骨架;進一步對開鏈的連接臂用五元吡咯烷環替換以提高構象穩定性,得到化合物6,7。酶學活性測試表明,化合物6、7的選擇性與活性增強,這證明了之前的假設是對的;但是化合物6、7存在代謝穩定性問題。進一步的體外代謝產物研究表明,五元吡咯烷被氧化是主要的代謝途徑。因此,作者將五元吡咯烷替換為四元的氮雜環丁烷,既保留了化合物的螺旋槳形狀,又保留了關鍵的相互作用特征,隨后的先導化合物優化中發現了化合物26,不僅具有強效的PI3Kγ/δ活性以及PI3Kβ的選擇性,而且大鼠與人的肝微粒體代謝穩定性良好。

聯系我們,獲取OpenEye/BROOD與EON試用


摇滚之夜怎么玩 2018最新版抢庄牌九 传奇国际电子平台 通比牛牛新手攻略 聚宝彩票网app 意甲 68彩票是黑平台吗 重庆时时全天计划 云南时时官网 时时彩定位胆必中法 河北时时11选五开奖结果查询结果 足球单双哪个概率大 雪缘园比分直播 江苏快三计划软件免费版 捕鱼达人2 白菜彩金论坛网 时时彩技巧软件